Конфокальный принцип точка датчика из патента Минсков
Принцип конфокальной микроскопии был запатентован в 1957 году Марвин Мински и стремится преодолеть некоторые ограничения традиционных широкоугольных микроскопов флуоресценции . В обычном (т.е. широкого поля) флуоресцентный микроскоп , весь образец затопляются равномерно свет от источника света. Все части образца в оптическом пути возбуждаются в то же время и в результате флуоресценции детектируют с помощью микроскопа фотодетектора или камер , включая большую несфокусированный фон часть. В противоположность этому, конфокальный микроскоп использует точку подсветки (см функция рассеяния точки) и крошечное отверстие в оптически сопряженной плоскости в передней части детектора, чтобы исключить из фокуса сигнала - название «конфокальной» происходит от этой конфигурации. Как только свет, излучаемый с помощью флуоресценции очень близко к фокальной плоскости можно обнаружить, изображение в оптическом разрешении , в частности, в направлении глубины образца, гораздо лучше, чем у широкого поле микроскопов. Тем не менее, так как большая часть света от образца флуоресценции блокируется на прокол, это повышенное разрешение за счет уменьшенной интенсивности сигнала - так долго воздействия часто требуются. Чтобы компенсировать это падение сигнала после того, как прокол , интенсивность света обнаруживается с помощью чувствительного детектора, как правило, фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или лавинным фотодиодом , превращая светового сигнала в электрический, который записывается с помощью компьютера.
Как только одна точка в образце освещена в то время, 2D или 3D изображений требуется сканирование над регулярной растра (т.е., прямоугольный шаблон параллельных линий сканирования) в образце. Луч сканируют поперек образца в горизонтальной плоскости с помощью одного или более (серво контролируется) осциллирующие зеркала. Этот метод сканирования, как правило, имеет низкую реакционную задержку и скорость сканирования может изменяться. Медленное сканирование обеспечивают лучшее отношение сигнал-шум , что приводит к лучшей контрастности и более высоким разрешением.
Достижима толщина фокальной плоскости определяется главным образом от длины волны используемого света, деленной на числовой апертуры этого объектива , но и оптических свойств образца. Тонкие оптические секционирования возможно делают эти типы микроскопов особенно хороши в 3D визуализации и профилировании поверхности образцов.
Последовательные срезы составляют «Z-стек», который может быть либо обработан определенным программным обеспечением для создания 3D-изображения, или он объединяется в 2D стеку (преимущественно максимальная интенсивность пикселя берутся, другие общие методы включают использование стандартного отклонения или суммирования пикселей).
Конфокальная микроскопия обеспечивает емкость для прямого, неинвазивного, серийного оптического секционирования интактных, толстых и живых особей с минимумом подготовки проб, а также незначительным улучшением в боковом разрешении. Биологические образцы часто обрабатывает флуоресцентные красители , чтобы сделать выбранные объекты видимыми. Однако, фактическая концентрация красителя может быть низкой, чтобы свести к минимуму нарушения биологических систем: некоторые инструменты могут отслеживать отдельные молекулы флуоресцентных. Кроме того, трансгенные методы могут создавать организмы, которые производят свои собственные флуоресцентные молекулы химерных (такие как сплав GFP, зеленого флуоресцентного белка с представляющим интерес белком). Конфокальные микроскопы работают по принципу точечного возбуждения в образце (дифракции ограничено точечные) и обнаружение точки результирующего сигнала флуоресцентного. Обскуры на детекторе обеспечивает физический барьер, который блокирует вне фокуса флуоресценции. Только в фокусе, или центрального пятна диска Эйри, записывается. Растровое сканирование образца в одной точке, в то время допускает тонкие оптические участки должны быть собраны путем простого изменения Z-фокус. Полученные изображения могут быть сложены, чтобы произвести 3D - изображение образца.
Четыре типа конфокальных микроскопов являются коммерчески доступным:
Конфокальные лазерные сканирующие микроскопы использовать несколько зеркала (обычно 2 или 3 сканирований линейно вдоль осей х и у-ось) для сканирования лазера на образец и «descan» изображения через фиксированную обскуру и детектор.
CLSM широко используется во многих биологических научных дисциплин, от клеточной биологии и генетики в области микробиологии и биологии развития . Он также используется в квантовой оптики и нано-кристаллической визуализации и спектроскопии.
Пример стопки конфокальной микроскопии изображений, показывающих распределение актиновых филаментов по всей клетке.
Клинический, КЛСМ используется при оценке различных глазных заболеваний, и особенно полезно для получения изображений, качественного анализа и количественной оценки эндотелиальных клеток в роговице . Он используется для локализации и идентификации присутствия нитевидных элементов грибов в роговичной стромы в случаях keratomycosis , что позволяет быстро поставить диагноз и тем самым раннее учреждение окончательной терапии. Исследование методов CLSM для эндоскопических процедур (эндомикроскопия) также показывает обещание. В фармацевтической промышленности, было рекомендовано, чтобы следить за процессом изготовления тонких фармацевтических форм пленки, чтобы контролировать качество и однородность распределения лекарственного средства.
CLSM используется в качестве механизма поиска данных в некоторых оптическом хранении данных 3D - системах и помог определить возраст папируса Магдалины .
Точка распространение функция точечного эллипсоид, несколько раз до тех пор, как это широко. Это ограничивает осевое разрешение микроскопа. Один из методов преодоления этого 4 π микроскопии , где падающий и излучаемый свет или могут мешать как сверху, так и снизу образца, чтобы уменьшить объем эллипсоида. Альтернативная методика конфокальной микроскопии тета . В этой технике конус осветительного света и детектируемый свет расположен под углом друг к другу (наилучшим результатам, когда они перпендикулярны). Пересечение двух форы функций дает гораздо меньший эффективный объем образца. Из этого эволюционировали одного самолета подсветки микроскопа . Дополнительно деконволюции могут быть использованы с использованием экспериментально полученной функции рассеяния точки , чтобы удалить из фокуса света, улучшая контраст в обеих осевых и боковых плоскостях.
Есть конфокальной варианты, которые достигают разрешения ниже дифракционного предела, такие как стимулированной эмиссии обедненной микроскопии (STED). Кроме этой техники широкое разнообразие других методов (не конфокальной основе) супер-разрешением доступны как пальмовое, (д) ШТОРМОВАЯ, SIM - карты, и так далее. Все они имеют свои преимущества, такие как простота использования, разрешение и необходимость специального оборудования, буфера или флуорофору.
Для образцов изображений при низких температурах, два основных подхода были использованы, как на основе лазерной сканирующей конфокальной микроскопии архитектуры. Один из подходов заключается в использовании непрерывного потока криостат : только образец находится при низкой температуре и ее оптической адресацией через прозрачное окно. Другой возможный подход заключается в части оптики (особенно объективного микроскопа) в криогенном сосуде Дьюара для хранения . Этот второй подход, хотя и более громоздким, гарантирует лучшую механическую стабильность и позволяет избежать потерь из - за окна.
Частичный профиль поверхности монеты 1-Евро, измеренная с помощью диска Нипкова конфокальной микроскопии.
Отражение данных для 1-монеты евро.
Первый конфокальный сканирующий микроскоп был построен Marvin Минсков в 1955 и патент была подана в 1957 году сканирование точки освещения в фокальной плоскости была достигнута путем перемещения стадии. Ни одно научное издание представлено не было, и никакие изображения, сделанные с ним не были сохранены.
Схема Тандем-сканирующей микроскопии Petran в. Красный бар добавлен, чтобы указать Нипкова-диск.
В 1960 году чехословацкий Моймир Petran медицинский факультет Карлова университета в Пльзене разработала Тандем сканирующая микроскоп, первый Коммерциализированный конфокальной микроскопии. Он был продан небольшой компании в Чехословакии и в Соединенных Штатах Tracor-Северной (позже NORAN) и используется вращающийся диск Нипкова , чтобы генерировать множественные возбуждения и эмиссии микроотверстий.
Патент чехословацкий был подан в 1966 году по Petran и Милан Hadravský, чехословацкого коллеги. Первая научная публикация с данными и изображениями, полученных с этим микроскопом была опубликована в журнале Science в 1967 году, автором которого является М. Дэвид Эггер из Йельского университета и Petran. В примечании к этой статье упоминается, что Petran разработан микроскоп и руководил его строительством, и что он был, частично, «научный сотрудник» в Йельском университете. Второе издание с 1968 описал теорию и технические детали прибора и имел Hadravský и Роберт Галамбос , руководитель группы в Йельском университете, в качестве дополнительных авторов. В 1970 году был выдан патент США. Он был подан в 1967 году.
В 1969 и 1971 годах, М. Дэвид Egger и Пол Davidovits из Йельского университета , опубликовал две статьи, описывающие первый конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Это была точка сканера, то есть только один освещение пятна был сгенерирован. Он используется эпи-освещение-отражение микроскопии для наблюдения нервной ткани. В 5 мВт гелий-неоновый лазер с длиной волны 633 нм свет отражался от полупрозрачного зеркала в направлении цели. Цель была простой объектив с фокусным расстоянием 8,5 мм. В отличии от всех предыдущих и наиболее поздних систем, образец сканировали движением этой линзы (цель сканирования), что приводит к перемещению фокальной точки. Отраженный свет вернулся к полупрозрачный зеркалу, передаваемая часть была ориентирована другой линза на точечным обнаружение, за которой фотоэлектронный умножитель был помещен. Сигнал визуализировали с помощью ЭЛТ осциллографа, электронно - лучевой был перенесен одновременно с целью. Специальное устройство позволило сделать Polaroid фотографии , три из которых были показаны в 1971 публикации.
Авторы размышляют о флуоресцентных красителях для исследований в естественных условиях. Они ссылаются на патент Минского, спасибо Стив Бэра, в то время докторант в Альберта Эйнштейна школы медицины в Нью - Йорке , где он разработал конфокальной линии сканирующего микроскопа, предложившего использовать лазер с «микроскопом Мински» и поблагодарить Галамбос, Hadravsky и Petran для дискуссий, ведущих к развитию своего микроскопа. Мотивация для их развития было то, что в Tandem-сканирующей микроскопии только фракция 10 -7 освещающего света участвует в генерации изображения в части глаза. Таким образом, качество изображения не было достаточным для большинства биологических исследований.
В 1977 году Колин JR Sheppard и Tony Wilson описал конфокальной с эпи-лазера-подсветкой, сканирование стадии и фотоэлектронных умножителей как детекторы. Этап мог перемещаться вдоль оптической оси (Z-ось), что позволяет оптические серийные срезы.
В 1979 году Фред Brakenhoff и его коллеги показали, что теоретические преимущества оптического секционирования и улучшения разрешения действительно достижимо на практике. В 1985 году эта группа стала первой публиковать убедительные снимки, сделанные на конфокальной микроскопии, которые были в состоянии ответить на биологические вопросы. Вскоре после того, как много больше групп начали использовать конфокальной микроскопии, чтобы ответить на научные вопросы, которые до сих пор осталось загадкой из - за технологических ограничений.
В 1983 IJ Cox унд С. Шеппард из Оксфорда опубликовал первую работу в соответствии с которым конфокальный микроскоп, управляемый компьютером. Первый коммерческий лазерный сканирующий микроскоп, этап-сканер SOM-25 был предложен Oxford оптоэлектроники (после нескольких TAKE-кадром, приобретенных BioRad), начиная с 1982 г. Она была основана на конструкции группы Oxford.
В середине 1980-х годов, Уильям Брэдшоу Амоса и Джона Грэма Уайта и его коллег, работающих в лаборатории молекулярной биологии в Кембридже была построена первая конфокальной луча сканирующего микроскопа. Стадии с образцом не движется, вместо того, чтобы освещенность пятно, что позволяет быстрее получения изображений: четыре изображения в секунду с 512 строк каждая. Сильно преувеличены промежуточные изображения, из - за путем луча длиной 1-2 метров, допускается использование обычной ирисовой диафрагмы как «обскура», с диаметром ~ 1 мм. Первые микрофотографии были приняты при длительном воздействии на пленку, прежде чем был добавлен цифровой фотоаппарат. Дальнейшее усовершенствование позволило масштабирование в подготовку в первый раз. Цейсс примерно в то же время привели к коммерческому CLSM распространяемого шведской компании Зарастро~d. Предприятие было приобретено в 1990 году молекулярной динамики, но в конце концов CLSM прекращено. В Германии, Heidelberg Instruments , основанная в 1984 году, разработал КЛСМ, который был первоначально означало для промышленного применения, а не биологии. Этот документ был передан в 1990 году Leica Lasertechnik . Цейсс уже не-конфокальной летающего пятна лазерного сканирующего микроскопа на рынке, который был повышен до конфокальной. В докладе 1990 года, отметив, «некоторые» производитель confocals списков: Sarastro, технический инструмент, Meridian Instruments, Bio-Rad, Leica, Tracor-северного и Цейс.
В 1989 году Фриц Карл Preikschat , с сыном Ekhard Preikschat, изобрел сканирующий лазерный диод микроскоп для анализа размера частиц. Он и Ekhard Preikschat соучредителем Lasentec коммерциализировать. В 2001 году Lasentec был приобретен Mettler Toledo (NYSE: МПД). Около десяти тысяч систем были установлены по всему миру, в основном в фармацевтической промышленности для обеспечения контроля в месте процесса кристаллизации в больших системах очистки.
В 50-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения меченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей . Для разрешения этой проблемы Марвин Минский , профессор в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент .
Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом .
где длина волны излучения, - числовая апертура объектива, - показатель преломления среды между образцом и объективом, - половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51) Однако, в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3-10 нм .
Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе.
Изображение представляет собой двумерную (2D) картину.
Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях - высота, ширина, глубина и время.
Wikimedia Foundation . 2010 .
У этого термина существуют и другие значения, см. Микроскоп (значения). Микроскоп, 1876 год … Википедия
Атомно силовой микроскоп Атомно силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM atomic force microscope) сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от дес … Википедия
Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия
- (англ. nitrogen vacancy center) или азото замещённая вакансия в алмазе это один из многочисленных точечных дефектов алмаза. Дефект представляет собой нарушение строения кристаллической решётки алмаза, возникающий при удалении атома… … Википедия
В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Мински. В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Минский. Марвин Ли Мински англ. Marvin Lee Minsky … Википедия
Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия
Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия
Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия
Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия
В настоящей главе будут рассмотрены основные принцы, устройство, применение конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ) на примере приборов фирмы Leica. Принцип КЛСМ – регистрация светового потока, исходящего из фокальной плоскости объектива при совпадении фокусов, т. е. диафрагма детектора должна быть позиционирована так, чтобы ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. В качестве источника освещения применяются лазеры и чувствительные детекторы для получения изображения.
Основная особенность КЛСМ состоит в возможности получения послойного изображения исследуемого объекта (например, клетки) с высоким разрешением и с низким уровнем шумов. Достигается это путем пошагового сканирования объекта сфокусированным пучком света от когерентного источника или столиком, использованием специфических флуоресцентных зондов и специальных методов ограничения световых потоков.
Системы сканирования в КЛСМ можно классифицировать следующим образом.
1. Сканирование лучом.
А) Зеркальные системы: однозеркальные, двухзеркальные, резонансные магнитоэлектрические.
Б) Световолоконные системы: одноволоконные, многоволоконные.
В) Сканирование объективом:
· пьезоэлектрическое перемещение объектива по осям Х, Y;
· пьезоэлектрическое перемещение объектива по оси Z.
Г) Акустооптические дефлекторы луча: два акустооптических дефлектора для сканирования по осям Х и Y.
Д) Дисковые системы:
· односпиральные односторонние и двухсторонние;
· многоспиральные односторонние и двухсторонние.
Е) Комбинированные системы: акустооптический дефлектор по оси Yи сканирование зеркалом по оси Х.
2. Сканирование столиком.
А) Шаговый привод: сканирующий столик с шаговыми двигателями по осям Х, Y, Z.
Б) Комбинированный привод: сканирующий столик с шаговым двигателем по осям X, Yи пьезоэлектрический привод по оси Z.
Рис. 5. Принципиальная схема работы КЛСМ.
1 - сканирующий столик; 2 - исследуемый образец; 3, 7 - объективы; 4 - сканирующее устройство; 5 - светоделительная пластина; 6 - луч света от лазера; 8, 12 - изображение точек В и С; 9 - игольчатая диафрагма; 10 - изображение точки А в центре игольчатой диафрагмы; 11 - приемник излучения; 13, 15 - свечение точек В и С, находящихся вне фокуса объектива 3; 14 - свечение точки А, находящейся в фокусе объектива 3.
Световой поток возбуждения 6 от лазерного источника поступает через светоделительную пластину 5, сканирующую систему 4 на объектив 3 и фокусируется в точку А плоскости исследуемого препарата (например, клетки), находящейся в фокусе. Полагаем, что внутриклеточные структуры связаны с флуоресцентными зондами и точку А фокусировки пучка можно рассматривать как точечный источник света, поток флуоресценции от которого через объектив 3, светоделительную пластину 5, объектив 7 фокусируется в плоскости игольчатой диафрагмы 9 ("pinhole") и регистрируется фотодетектором 11. Освещенность потоком возбуждения фрагментов препарата, лежащих вне фокуса объектива вдоль оптической оси (точки В и С), ниже, чем в точке А. Следовательно, составляющая освещенности мишени детектора от точек В и С может быть существенно уменьшена. Потоки флуоресценции, исходящие от точек В и С, лежащих вне фокуса, ограничиваются точечной диафрагмой и на детектор не попадают, либо попадает их малая часть. Таким образом, при сканировании препарата в плоскости XY детектором регистрируется сигнал, уровень которого определяется расстоянием от плоскости сканирования вдоль координаты Z. Совмещение фокуса объектива 3 с плоскостью сканирования и фокуса объектива 7 с игольчатой диафрагмой отражено в термине "конфокальность". Пошаговое перемещение плоскости сканирования вдоль оси Z позволяет получить серию контрастных послойных изображений и реконструировать внутреннюю трехмерную структуру (3-D) исследуемого объекта. Качество изображения, разрешение в плоскости XY и вдоль оси Z зависит от качества оптики, качества сканирующих систем, размеров и точности изготовления точечной диафрагмы, жесткости конструкции, эффективности используемых алгоритмов обработки сигналов, специфичности флуоресцентных зондов.
Для определения пространственной разрешающей способности микроскопа проводят анализ изображения точечного источника света. Изображение точечного источника, формируемое обычной линзой, представляет собой дифракционное пятно Эри, состоящее из яркого центрального ядра и более слабых внешних колец.
Рис. 6. Дифракционное пятно Эри.
Два точечных источника одинаковой яркости, расстояние между которыми равно d, видны как две различные точки, если расстояние между центрами кружков Эри превышает следующее значение:
r A = XY =0,6 λ/NA,
где r A - радиус первого темного кольца в кружке Эри, λ- длинна волны источника света в нм, NA – числовая апертура.
Это выражение называют критерием Рэлея. Оно определяет разрешающую способность микроскопа в плоскости образца (XY). При этом предел разрешения определяется прежде всего волновой природой света, и поэтому его часто упрощают, считая NA=1. В КЛСМ формирования изображения приводит к небольшому уменьшению размера пятна Эри. Интенсивность пятна Эри для стандартного микроскопа уменьшается по закону n -2 ,где n - поперечное смещение, а для КЛСМ интенсивность уменьшается как n -4 . Это приводит к увеличению разрешающей способности КЛСМ в 1,5 раза. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:
XY c r =0,4 λ/NA,
где XY c r – разрешающая способность КЛСМ.
Для оценки преимущества КЛСМ, рассмотрим аппаратную функцию (структуру пятна Эри) и проанализируем разрешающую способность микроскопа в осевом направлении (Z). Трехмерное пятно Эри (распределение интенсивности), является трехмерной аппаратной функцией (ТАФ) которая определяет изображение объекта. ТАФ для обычного микроскопа имеет коническую форму, расширяющуюся вверх и вниз от центра, тогда как для конфокального микроскопа она имеет эллиптическую форму и менее вытянута в осевом направлении.
Рис. 7. Вид трехмерной аппаратной функции точечного источника обычного микроскопа – (а) и КЛСМ – (б).
Критерий Рэлея применим и для определения разрешающей способности микроскопа в направлении оптической оси. Для обычного микроскопа два точечных источника, расположенные на некотором расстоянии вдоль оптической оси, можно разрешить, если максимумы их пятен Эри находятся на расстоянии:
Z r =2 λ/NA 2 ,
где Z r - осевая разрешающая способность микроскопа.
Распределение энергии в пятне Эри для КЛСМ более узкое, и разрешающая способность в осевом направлении в 1,4 раза выше. Для конфокального микроскопа критерий Рэлея имеет вид:
Z r c =1,4 λ/NA 2 ,
где Z r c - осевая разрешающая способность КЛСМ.
Современные КЛСМ имеют одно главное преимущество - возможность получения тонких оптических срезов. На качество изображения при получении тонких оптических срезов влияют следующие параметры:
· размер конфокальной диафрагмы;
· числовая апертура объектива NA;
· показатель преломления;
· поглощение света в образце.
Уменьшение интенсивности света по мере увеличения толщины образца влияет на разрешение микроскопа по оптической оси Z. Разрешение зависит от оптики микроскопа и образца. Толщину оптического сечения в конфокальном микроскопе обычно характеризуют шириной распределения на полувысоте пика интенсивности ∆z 1/2 = 0,65мкм. Если образец и детектор идеальны, этот параметр зависит от числовой апертуры объектива, длины волны λ и показателя преломления иммерсионной среды n i .
Рис. 8. Зависимость осевой разрешающей способности микроскопа ∆z 1/2 от числовой апертуры объектива.
В КЛСМ перед детектором ставится регулируемая диафрагма, изменяющая количество света. Игольчатые диафрагмы предназначены для создания условий максимальной или полной фильтрации света, попадающего в плоскость формирования изображения от точек, не совпадающих с фокальной плоскостью или находящихся рядом с анализируемым элементом объекта в фокальной плоскости. Размер игольчатой диафрагмы конечен, и от него зависят поперечное разрешение прибора, яркость освещенных элементов препарата, смещенных относительно фокальной плоскости по оси Z, и глубина резкости. Размер диафрагмы влияет на толщину получаемого сечения. Чем меньше диафрагма, тем ближе толщина сечения к теоретическому пределу (шириной распределения на полувысоте пика интенсивности), а при очень больших апертурах способность получать тонкое сечение становится невозможным.
Как говорилось ранее, КЛСМ дает возможность получать оптическое сечение на значительной глубине от поверхности образца, при этом важным моментом является показатель преломления и проблема глубины. Прохождение падающего и отраженного луча через образец влияет на качество изображения. Если показатели преломления иммерсионной среды и образца близки (влияние разности показателей преломления иммерсионной жидкости и объекта на появление рассеянного света, снижающего контраст изображения и действующего как эффект сферической аберрации), световой конус будет сходиться. Если же показатели преломления различаются, появляется сферическая аберрация.
Рис. 9. Показатели преломления иммерсионной среды и образца.
а – формирование изображения иммерсионным объективом без аберрации; б – сферическая аберрация, обусловленная несоответствием показателей.
При разных показателях преломления световые лучи, идущие на различном расстоянии от оптической оси, в одну точку не фокусируется, что приводит к потере качества изображения. По возможности показатели преломления образца и объектива должны быть согласованы. Если показатели преломления образца и иммерсионной среды различаются, изображение объекта на глубине размыто вдоль оптической оси, а плоскость фокуса сдвинута. Для увеличения глубины проникновения объектив должен иметь большую числовую апертуру, например иммерсионный объектив. Однако такие объективы имеют малое максимальное расстояние от линзы объектива до фокальной плоскости. На глубину проникновения влияет неоднородность образца, которая приводит к снижению интенсивности света на большой глубине и появлению тени. В идеале образец, позволяющий достичь максимальной глубины проникновения и максимального разрешения, должен иметь показатель преломления, равный показателю преломления объектива, но это однородный образец, а таких биологических образцов не существует.
Во время сканирования КЛСМ получает ряд оптических сечений с регулярно возрастающей глубиной от поверхности образца. Для большинства КЛСМ получение сотни 2D-изображений занимает всего несколько минут. Оптическое изображение можно получить двумя способами:
1) получение последовательности оптических сечений в плоскости XY, расположенных на расстоянии ∆z друг от друга. Сопоставление координат центров объектов в различных сечениях дает возможность определить их ориентацию и распределение по длине.
Рис. 10. Изучение трехмерной структуры в плоскости XY.
2) получение ряда оптических сечений в плоскости XZ, расположенных на расстоянии ∆y. Если образец параллелен плоскости сечения, то его сечение в плоскости XZ будет почти круглым, при сопоставлении изображений в различных XZ сечениях, можно определить изогнутость исследуемого объекта.
Рис. 11. Изучение трехмерной структуры в плоскости XZ.
Трехмерная реконструкция исследуемых объектов методами КЛСМ направлена на решение двух задач:
· визуализации объемного изображения объекта, полученного путем "сборки" его оптических срезов;
· количественного анализа внутренних структур объекта.
На сегодняшний день существует достаточно много фирм производителей КЛСМ. Инновации фирм-производителей КЛСМ:
· 2002 г. фирма Leica анонсировала акустооптический светоделитель (AOBS), позволяющий эффективно разделять лазерный луч возбуждения и люминесценцию;
· 2002 г. фирма Carl Zeiss начала выпускать конфокальный микроскоп LSM 510 META с оригинальным фотоприемником, регистрирующим сигнал одновременно в 32-х спектральных каналах;
· 2004 г. Zeiss создает высокоскоростной LSM 5 Live, имеющий скорость сканирования в 20 раз выше обычного КЛСМ;
· Фирма Olympus разработала прибор с двумя сканерами, позволяющий более эффективно применять, например, методику FRAP;
· Nikon - создает компактный и недорогой КЛСМ упрощенной конструкции;
· 2007 год фимра Leica объявила о выпуске 4Pi-конфокального микроскоп, улучшающий аксиальное разрешение в 4 - 7 раз.
Рассмотрим устройство КЛСМ относящегося к новому более совершенному поколению приборов – TCS SP5 фирмы Leica.
Рис. 12. Многофотонная/конфокальная широкополосная система TCS SP5 (инвертированный микроскоп).
Ключевые элементы КЛСМ TCS SP5: AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр, AOBS – акусто-оптический светоделитель, SP-Detector – датчик спектрального фотометра.
AOTF – акустико-оптический настраиваемый фильтр – служит для минимизации оптического экспонирования, настраивает мощность лазера в зависимости от образца и флуорохрома. Позволяет выбрать необходимую длину волны и управлять интенсивностью света возбуждения. AOTF - представляет собой электрически перестраиваемый фильтр, работающий на принципе объемной дифракции светового пучка на неоднородностях показателя преломления. Такие неоднородности возникают при возбуждении в двулучепреломляющих кристаллах ультразвуковой акустической волны. При анизотропной дифракции в одноосных кристаллах существует минимальная частота ультразвука, при которой углы падения и дифракции совпадают, и происходит так называемое коллинеарное акустооптическое взаимодействие.
Рис. 13. Акустико-оптический настраиваемый фильтр.
AOBS – акусто - оптический светоделитель, это акусто-оптический кристалл – настраиваемое преломляющее устройство, работающее в реверсивном режиме. Что дает использование AOBS:
1. Для получения четкого, с низким уровнем шума, изображения необходима высокая степень светопропускания. Уменьшение же шума за счет усреднения изображения по многим последовательным сканированиям с необходимостью приводит к фотообесцвечиванию изучаемого объекта. Степень светопропускания AOBS превосходит большинство дихроичных зеркал во всем видимом диапазоне спектра. Следовательно, требуется усреднение по меньшему числу сканирования. В результате препарат просуществует гораздо дольше;
2. Яркие и четкие изображения требуют прохождения как можно большего числа фотонов от объекта к детектору, что улучшает качество изображения. AOBS обеспечивает регистрацию максимально широких полос флуоресценции, то есть максимального числа фотонов;
3. Низкое обесцвечивание во время получения изображения важно для защиты образца от выцветания, а живых объектов от токсичных продуктов фотолиза флуорохромов. Кривые светопропускания AOBS имеют очень крутые наклоны, что позволяет регистрировать флуоресценцию флуорохрома максимально близко к полосе его возбуждения;
4. Может быть возбужден любой краситель видимого диапазона, так как отражение может настраиваться индивидуально;
5. Решен вопрос многопараметрической флуоресценции: можно запрограммировать до восьми линий излучения лазера, оставляя достаточно места для регистрации флуоресценции, при этом частоты настраиваются;
6. Соотношение красителей, как соотношение возбуждения метаболит - проб, например, для Са 2+ , мембранного потенциала, водородного показателя должно быстро переключаться при последовательном сканировании. AOBS переключается за несколько микросекунд;
7. Регистрация изображения в отраженном свете - еще одна возможность использования. AOBS позволяет настраивать прохождение отраженного возбуждающего света индивидуально;
8. Сканирование ROI (последовательное сканирование и сканирование определенной зоны) также улучшено: различные режимы возбуждения применимы для различных областей во время отдельного сканирования;
9. Большой объем 3D записей, в последовательном режиме выигрывает от устройств с быстрым переключением, так как скорость увеличивает эффективность системы;
10. Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) требует низкого фона и малого светорассеяния Только AOBS эффективно блокирует близкие линии излучения, например, от Аr лазеров;
11. Спектральная запись (Лямбда сканирование) обеспечивает точный спектр, так как светопропускание AOBS «белое», а это значит, что он не вносит изменений в спектр испускания - что является обычной проблемой при выполнении спектрального сканирования в системе с дихроичными зеркалами;
12. Для истинного конфокального получения оптических срезов необходимо точечное освещение и точечная регистрация флуоресценции. AOBS подходит для работы с конфокальными устройствами точечного сканирования;
13. Получение изображения в мультифотонном режиме либо при ультрафиолетовом возбуждении может быть выполнено параллельно без ошибок или ограничений. AOBS не меняет возбуждение лазеров невидимого диапазона и не меняет спектр флуоресценции;
14. Невозможно выполнить ошибочную операцию, так как AOBS контролируется совместно с управлением возбуждения при помощи AOTF (акустико-оптический настраиваемый фильтр). Если выбрана линия возбуждения, то и AOBS запрограммирован в соответствии с ней. Оператору не надо принимать решения - работа выполняется правильно и автоматически;
15. Отсутствует разюстировка, так как нет подвижных элементов присущих фильтровым барабанам и слайдерам. Кристалл прочно установлен, программирование выполняется электронным способом;
16. Нет необходимости в дорогостоящем дополнительном оборудовании, например, фильтровых кубиков, слайдеров дихроичных зеркал и т.д. Поэтому гораздо меньше расходы на техническую помощь для установки новых оптических элементов.
Рис. 14. AOBS – акусто - оптический светоделитель.
SP-Detector – датчик спектрального фотометра. Свет от образца, являющийся суммой спектров вызванной флуоресценции проходит pinhole диафрагму, которая формирует конфокальный оптический срез. Далее при помощи призмы этот свет раскладывается в спектр. При прохождении первого детектора, свет проходит устройство щелевого фотометра, состоящего из двух шторок с приводом. Эти шторки обрезают края спектра с обеих сторон диапазона и направляют к сенсорам 2 и 3 порядка. В итоге спектр раскладывается одновременно на пять каналов. В итоге при использовании SP – детектора регистрируется излучение от различных красителей в образце.
Рис. 15. Спектральный детектор SP.
SP – детектор позволяет производить лямбда-сканирование: спектральные изображения накапливаются для анализа характеристик красителей, задействованных в эксперименте, сразу.
В этой книге в краткой форме изложен материал, необходимый для освоения современных методов конфокальной лазерной микроскопии. Часть из описанных в тексте практических приемов разработана и усовершенствована авторами издания. Отличительной особенностью данной книги является сочетание ключевых моментов из теории современных методов микроскопии с примерами использования различных приемов конфокальной микроскопии и иммуноцитохимии на практике. В приложениях приводятся необходимые сведения о спектральных характеристиках флуорохромов и протоколы иммуноцитохимических реакций, использованных авторами для получения изображений препаратов и построения трехмерных реконструкций микроскопических объектов. Настоящее руководство может являться справочным пособием для специалистов, применяющих в своей работе флуоресцентные методы и конфокальную микроскопию, а также будет полезно для студентов биологических и медицинских факультетов, изучающих морфологические и нейробиологические дисциплины.
компанией ЛитРес .
ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ И КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ МИКРОСКОПИЯ – ПРИНЦИПЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ
Большинство биологических объектов обладают низким контрастом внутренних структур, которые в основном прозрачны, поэтому возможности их наблюдения методом классической микроскопии светлого поля ограничены. Эта проблема может быть преодолена несколькими путями: применением метода исследования в темном поле, использованием метода фазового контраста, для двулучепреломляющих материалов применяют поляризационный контраст. Основным же методом контрастирования в биологии является окрашивание препаратов веществами, способными связываться с препаратом и поглощать свет или флуоресцировать. Последние называют флуорохромами.
1.1. Основные понятия
Флуорохромы (флуоресцентные красители)1 – это вещества, которые способны связываться с объектом и расходовать часть энергии поглощенного света на флуоресценцию. Под флуоресценцией понимают способность ряда веществ после поглощения света с одной длиной волны излучать свет с другой длиной волны. Напомним, что электроны в атомах расположены на энергетических уровнях; расстояние между уровнями является характеристикой молекулы. При облучении вещества светом возможен переход электронов на более высокий энергетический уровень. Разница энергии между энергетическими уровнями и частота колебаний поглощенного света связаны между собой уравнением Бора (постулат Бора):
где ΔЕ – разность энергий между уровнями; v – частота; λ – длина волны; h – постоянная Планка; с – скорость света.
После поглощения света часть полученной системой энергии расходуется в виде тепла, а часть может быть излучена в виде фотона. Согласно правилу Стокса, длина волны испускаемого света больше, чем длина волны поглощаемого, или, другими словами, максимум спектра излучения сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн. С физическими основами описанных выше процессов более подробно можно ознакомиться в учебнике Р. Фейнмана (2011).
Каждый флуорохром характеризуется определенным спектром поглощения и испускания. Например, один из самых распространенных флуоресцентных красителей – FITC (fluorescein-5-isothiocyanate) – имеет максимум поглощения l ex = 492 нм, а максимум излучения для него составляет l em = 518 нм. Другой распространенный флуорохром, 5-TAMRA (5-carboxytetramethylrhodamine), имеет l ex = 543 нм и l em = 570 нм. На величину стоксова сдвига также влияет полярность среды, в которой находится флуорохром.
Наиболее интенсивной флуоресценции флуорохрома можно добиться, облучая его светом с длиной волны, близкой к максимуму поглощения, однако возможно перевести флуорофор в возбужденное состояние и при облучении его светом с длиной волны, существенно отличающейся от его максимума поглощения. Например, флуорофор можно перевести в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами (мультифотонное возбуждение), что будет эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Так, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм.
Еще одной характеристикой флуорохрома является квантовый выход – отношение интенсивности поглощаемого и испускаемого света. Квантовый выход (Q ) может быть выражен через отношение интенсивности флуоресценции (F ) к разности интенсивностей падающего (I 0) и выходящего (I ) световых потоков:
Заметим, что квантовый выход всегда меньше единицы из-за «стоксовских» потерь. В зависимости от квантового выхода флуорохромы разделяют на слабые и сильные. Современные синтетические флуорохромы, как правило, обладают высоким квантовым выходом и являются сильными.
Для характеристики способности флуорохрома поглощать свет определенной длины волны вводят понятие молярного коэффициента экстинкции, который определяется как оптическая плотность одномолярного раствора вещества при толщине светопоглощающе-
го слоя в 1 см. Молярный коэффициент поглощения имеет размерность л ⋅ моль - 1 ⋅ см - 1 . Он зависит от природы вещества и от длины волны проходящего света. Величина, полученная путем перемножения молярного коэффициента экстинкции на величину квантового выхода, характеризует яркость флуоресценции флуорохрома при заданной длине волны. Время облучения, при котором флуорохром теряет 50 % яркости, называют фотостабильностью. «Идеальный» флуорохром должен иметь высокий квантовый выход и хорошую фотостабильность. Современные флуорохромы на основе полупроводниковых нанокристаллов (квантовых точек) по этим показателям на порядок превосходят органические соединения (Олейников В. А., 2011).
Еще один важный параметр - время жизни возбужденного состояния , которое определяется как среднее время нахождения молекулы в возбужденном состоянии до того, как вернуться в основное состояние. Время затухания флуоресценции флуорохрома (τ) описывается формулой:
где Г – константа скорости излучательной дезактивации флуорофора; k – обобщенная константа скорости безызлучательной дезактивации.
Обычно время затухания флуоресценции составляет около 10 нс.
Тушением флуоресценции называют любые процессы, которые уменьшают интенсивность флуоресценции данного вещества. К тушению может приводить множество процессов: химические реакции в возбужденном состоянии, перенос энергии, образование комплексов, тушение при столкновениях. К тушению флуоресценции относятся также процессы кажущегося тушения, которое обусловлено оптическими свойствами образца (высокая оптическая плотность, мутность). Для тушения флуоресценции требуется контакт между молекулами флуорохрома и тушителя. Если тушитель диффундирует к флуорохрому, пока последний находится в возбужденном состоянии, и в результате контакта флуорохром возвращается в основное состояние без излучения фотона, говорят о динамическом тушении. Статическое тушение происходит при образовании нефлуоресцирующего комплекса между флуорохромом и тушителем. При увеличении концентрации флуорохрома возможно самотушение флуоресценции как результат поглощения молекулами вещества собственного излучения. Возможно также поглощение флуоресцентного излучения одного флуорохрома другим. К тушителям флуоресценции относят молекулярный кислород, ароматические и алифатические амины, ксенон, пероксид водорода, акриламид, оксид азота, нитрометан, нитроксиды, хлороформ, трихлорэтанол, бромбензол. Следует отметить, что не все флуорохромы тушатся любыми из вышеперечисленных веществ, однако (в зависимости от условий эксперимента) почти всегда можно подобрать эффективную пару флуорохром-тушитель или, напротив, избежать тушения флуоресценции (что более важно в морфологических исследованиях).
Для флуорохромов характерна анизотропия флуоресценции . Анизотропия – это зависимость свойств вещества от направления. При возбуждении поляризованным светом селективно возбуждаются только те молекулы флуорохрома, для которых дипольный момент перехода при поглощении параллелен электрическому вектору возбуждающего излучения. Такое селективное возбуждение частично ориентированного набора флуорохромов приводит к частично поляризованному испусканию флуоресценции. В общем случае анизотропия флуоресценции r выражается формулой:
где Iv и Ih – интенсивности флуоресценции вертикально и горизонтально поляризованного испускания в случае возбуждения образца вертикально поляризованным светом.
При планировании экспериментов с использованием флуорохромов, особенно флуорохромов нового поколения – квантовых точек – необходимо учитывать возможность мерцания флуоресценции. Это стохастический процесс перехода флуорохрома из флуоресцирующего состояния в состояние отсутствия флуоресценции, несмотря на постоянное возбуждение. В результате, при наблюдении за одиночными флуоресцирующими комплексами возникает стробоскопический эффект (зрительная иллюзия неподвижности или мнимого движения предмета при его прерывистом наблюдении). Кроме этого, поскольку время нахождения флуорохрома во «включенном» и «выключенном» состоянии является случайным, сравнение результатов независимых экспериментов при использовании таких флуорохромов затруднено. При конфокальной микроскопии данный эффект может быть компенсирован за счет линейного или покадрового усреднения сканируемых изображений.
1.2. Устройство флуоресцентного микроскопа
Прототип флуоресцентного микроскопа был разработан в начале ХХ в. Августом Келлером, который при конструировании микроскопа использовал в качестве источника света дуговую кадмиевую лампу. Затем немецкий физик Генри Фридрих Зидентопф, работая в оптических мастерских Цейса (в 1907 – 1938 гг. директор лаборатории микроскопии), совместно с Рихардом Зигмонди изобрел (1903) щелевой ультрамикроскоп. Еще через восемь лет (1911) Oskar Heimstдdt сконструировал первый флуоресцентный микроскоп и применил его для исследования явления автофлуоресценции органических и неорганических объектов. Однако в то время было трудно добиться эффективного разделения флуоресцентного сигнала от возбуждающего света. Эта проблема была преодолена Philipp Ellinger и August Hirt в 1929 г., которым удалось разработать так называемый эпифлуоресцентный микроскоп. В предложенной ими конфигурации микроскопа освещение препарата и детекция флуоресцентного сигнала осуществлялась с одной стороны от образца, поэтому объектива достигал только отраженный возбуждающий и излучаемый свет. Прорыв в развитии флуоресцентной микроскопии связан с появлением лазеров (60-е гг. XX в.), с помощью которых удалось добиться высокой степени пространственной и временной когерентности светового пучка. Кроме того, стало возможным эффективно разделять сигналы, используя дихроичные зеркала.
Принципиальная схема современного флуоресцентного микроскопа представлена на рис. 1.
Свет от источника проходит через фильтр возбуждающего излучения. При этом из спектра выделяются только те компоненты, которые необходимы для возбуждения флуоресценции. Затем свет попадает на дихроичное зеркало (светоделитель). Отраженный светоделителем свет попадает в объектив флуоресцентного микроскопа и фокусируется на образце, возбуждая флуоресценцию. Флуоресцентный сигнал (смещенный в длинноволновую область (согласно Правилу Стокса)) , а также рассеянное излучение возбуждения достигает светоделителя, но, в отличие от возбуждающего света, проходит через дихроичное зеркало, после чего рассеянное излучение отсеивается эмиссионным фильтром и на детектор попадает только излучение флуоресценции.
Источник возбуждающего света. В настоящее время используются три типа источников света: лампы высокой мощности (ртутные, ксеноновые и их аналоги), диоды и лазеры. Ртутная лампа – это газоразрядный источник света, в котором при электрическом разряде в парах ртути под высоким давлением возникает оптическое излучение преимущественно в ультрафиолетовой области спектра. Такие источники света являются малоэффективными, поскольку они производят большое количество избыточной тепловой и световой энергии по сравнению с энергией, требуемой для возбуждения флуоресценции. Флуоресцентные микроскопы могут быть укомплектованы ртутными лампами мощностью 50 – 200 W. Использование более мощной лампы позволяет возбудить с достаточной эффективностью даже слабый флуорохром, но при этом необходимо учитывать, что увеличение мощности лампы влечет за собой увеличение скорости выгорания флуорохромов.
Рис. 1. Принципиальная схема флуоресцентного микроскопа
В ксеноновой лампе вспышка происходит после ионизации газа и прохождении через него мощного импульса электрического тока, поданного на поджигающий электрод. В результате этого электроны в молекуле ксенона занимают орбиты с более высокими энергетическими уровнями и, возвращаясь на прежние орбиты, излучают энергию в виде фотонов. Ксеноновая лампа имеет непрерывный спектр излучения в широком спектральном диапазоне, что не всегда пригодно для возбуждения флуоресценции. Такие лампы обычно используют при работе с флуорохромами, требующими для возбуждения длинноволновый свет (красной и инфракрасной области).
Вместо ртутной или ксеноновой лампы можно использовать металлогалогенную лампу (metal halide lamp ). Это газоразрядная лампа высокого давления. Внутри колбы размещается кварцевая или керамическая цилиндрическая горелка, в которой находятся галогениды некоторых металлов (йодиды натрия, таллия, индия и др.), инертный газ (преимущественно ксенон и аргон) и металлическая ртуть. При подаче на лампу питающего напряжения происходит зажигание дугового разряда, металл начинает испаряться, его атомы возбуждаются, что приводит к возникновению излучения. В зависимости от состава металлов различаются и спектры излучения ламп. Обычно компоненты подбираются так, чтобы компенсировать недостаток красного и желтого света в спектре ртути, что немаловажно при использовании возбуждаемых светом этого диапазона флуорохромов (например, флуоресцеина). Кроме этого, лампы данного типа компактны, экономичны в использовании, для них характерен пониженный уровень тепловой отдачи.
Источник возбуждения флуоресцентного излучения может быть выполнен в виде одного или нескольких светоизлучающих диодов, причем возможно использование диодов, имеющих как одинаковую длину волны излучения, так и различную. Применение светодиодов позволяет избежать нагревания системы, увеличивает срок ее эксплуатации.
Лазеры в качестве источника света используются в основном в сканирующих устройствах для обеспечения высокой интенсивности освещения в узкой спектральной области и на малой площади образца. В таких микроскопах остросфокусированные световые лучи лазера сканируют образец точку за точкой. Поскольку лазеры испускают свет в узкой спектральной области, пропадает необходимость применения возбуждающих светофильтров. Однако при использовании флуорохромов, которые возбуждаются на разных длинах волн, требуется применять разные лазеры или же прибегать к различного рода приемам.
Фильтры.
Фильтр возбуждающего света подбирается таким образом, чтобы он выделял из спектра лампы свет той длины волны, которая максимально эффективно поглощается флуорохромом. Например, выпускаются светофильтры под стандартные флуорохромы для «синей», «зеленой», «красной» люминесценции или под несколько стандартных флуорохромов (например, возбуждающий светофильтр BP 560/40 нм для «красной» люминесценции или возбуждающий светофильтр под несколько флуорохромов BP 370/40, BP 474/28, BP 585/35 нм производства фирмы Carl Zeiss).
Дихроичные зеркала (интерференционные светофильтры) имеют специальное интерференционное покрытие, позволяющее отражать свет, длина волны которого меньше определенного значения, и пропускать излучение с большей длиной волны. В данном случае возбуждающее излучение отражается, а сигнал флуоресценции полностью пропускается. Для получения таких фильтров на поверхность прозрачной пластины наносят несколько (от 10 до 200) слоев материала с чередующимися высоким и низким показателями преломления. Например, PbCl2, TiO2, ZnS (показатель 2,2 – 2,3) и MgF 2 , SiO 2 , Na 3 AlF 6 (показатель 1,3 – 1,4). Толщина каждого слоя тщательно выдерживается (используется техника вакуумного напыления), поскольку этот параметр определяет положение максимума кривой пропускания. От числа слоев зависит ширина зоны пропускания фильтра и степень подавления «ненужной» части спектра.
Запирающие фильтры (band pass BP). При конструировании запирающих фильтров используют комбинацию длинноволновых отрезающих (shot pass filter, или SP filter) и длинноволновых пропускающих (long pass filter, или LP filter) фильтров. Первые задерживают длинноволновый свет, но пропускают коротковолновый, а LP-фильтры, напротив, пропускают длинноволновый свет, задерживая коротковолновый. Комбинируя эти фильтры, можно добиться того, что через фильтр будет проходить только свет определенного участка спектра. Запирающий фильтр выбирают в соответствии с фильтром возбуждающего света. Например, при установке возбуждающего светофильтра BP 560/40 нм используют запирающий светофильтр BP 630/75 нм.
Сближение в пространстве всех светофильтров позволило объединить их в единый светоделительный модуль. Такая конструкция обеспечивает производство легкой замены или смены модуля и дает возможность применять несколько флуорохромов одновременно, с высокой точностью совмещая полученные изображения. При приобретении флуоресцентного микроскопа необходимо серьезно подходить к вопросу о выборе светоделительных модулей, принимая во внимание поставленные задачи и спектральные характеристики имеющихся флуорохромов. Если планируется использовать несколько флуоресцентных красителей, необходимо учитывать, что спектры излучения флуорохромов не должны перекрываться. В противном случае возможны ошибки в интерпретации данных.
Детекторы флуоресцентного сигнала. Усиление и детектирование сигнала производится с помощью фотоэлектронного умножителя (ФЭУ) и цифровой видеокамеры. ФЭУ – это электровакуумный прибор, в котором поток электронов, излучаемый фотокатодом, усиливается в умножительной системе в результате вторичной электронной эмиссии. В результате фотоэффекта при попадании фотона на фотокатод из него вылетают электроны, которые, ускоряясь в электрическом поле, направляются на систему динодов (специальный электрод), где за счет вторичной электронной эмиссии образуют нарастающую (от динода к диноду) электронную лавину, поступающую на анод. Обычно коэффициент усиления ФЭУ (число электронов, достигших анода при выбивании из фотокатода одного электрона) составляет около 10 6 , что позволяет получить на выходе ФЭУ легко регистрируемый сигнал.
Цифровые камеры в качестве светочувствительного элемента имеют CCD-матрицу (charge-coupled device), она же ПЗС-матрица (сокр. от «прибор с зарядовой связью»). CCD-матрица является специализированной интегральной аналоговой микросхемой, которая представляет собой набор резисторов. Количество этих ячеек (элементов) в матрице является основной определяющей разрешения и качества картинки. Принцип работы CCD-матрицы следующий: свет, попавший на матричные элементы, преобразуется в электрический заряд, формируется зарядовая картина, которая пропорциональна освещенности в каждой ячейке. Матрица может «накапливать» заряды в течение определенного периода времени. Общий заряд, накопленный в ячейке, равен произведению зарядов на время экспонирования. Для получения цветной картинки, как правило, световой луч еще проходит через набор специальных светофильтров/призм зеленого, синего и красного цвета. С более подробным описанием принципов работы отдельных модулей флуоресцентного микроскопа можно ознакомиться в пособии В. И. Голышевской [и др.] (2008) и в работе H. C. Ishikawa-Ankerhold (2012).
1.3. Принципы конфокальной микроскопии
Конфокальная микроскопия является разновидностью флуоресцентной микроскопии с улучшенным разрешением вдоль оптической оси объектива, которое достигается за счет использования принципа конфокальной фильтрации флуоресценции. Концепция конфокальной микроскопии была предложена Marvin Minsky в 50-е гг. XX в. для исследования ткани головного мозга без предварительного окрашивания. В разработанном им микроскопе свет последовательно фокусировался на разных точках образца. С целью устранения шумового сигнала от участков, расположенных вне плоскости фокуса, использовалась диафрагма. Она находилась в плоскости, сопряженной с плоскостью фокуса объектива, таким образом, что при проецировании диафрагмы на объект ее изображение точно совпало с фокусом освещающего объект света. При таком устройстве системы свет из областей вне фокуса задерживался диафрагмой и на детектор попадал только сигнал из фокуса объектива. Изменяя диаметр диафрагмы, можно было варьировать толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измерялся сигнал. Сканирование плоскости образца по точкам позволяло получить полное изображение. Исходя из этого принципа, возникло и название метода – «конфокальный» – основанный на сопряжении фокусов. Однако при таком устройстве микроскопа на изображении было слишком много помех из-за использования слабых источников освещения. Вероятно поэтому изобретение Minsky осталось почти без внимания. Интерес к нему вернулся только после изобретения лазера. Более подробно исторические аспекты создания конфокального микроскопа приведены в обзоре Н. Н. Лукашевой [и др.] (2008).
В современном конфокальном микроскопе источником возбуждающего света является лазер. Преимуществом лазеров по сравнению с ламповыми источниками света заключается в монохроматичности генерируемого света и малой расходимости светового пучка. Монохроматичность возбуждающего флуоресценцию света дает возможность расширить спектральный диапазон регистрируемой флуоресценции и улучшить подавление светорассеяния на длине волны возбуждения. Малая расходимость пучка света способствует более эффективной работе оптической системы микроскопа, уменьшает число бликов, связанных с отклонением света от расчетного оптического пути, улучшает точность фокусировки пучка света и уменьшает объем, в который можно сфокусировать свет на образце. На рис. 2 показана принципиальная схема современного лазерного конфокального микроскопа.
Лазер излучает свет, формируя узкий световой пучок. Затем свет проходит через систему линз (расширитель пучка) и попадает на светоделитель, который отражает возбуждающий свет, направляя его на систему зеркал (на схеме не показана), позволяющих изменять направление луча во взаимно перпендикулярных плоскостях. Светоделитель обеспечивает высокоэффективное отражение света на длине волны генерации лазера и почти стопроцентное пропускание света в остальном спектральном диапазоне. Далее свет через объектив фокусируется в определенной точке образца, возбуждая флуоресценцию. При этом лазерный луч может возбуждать флуоресценцию во всех слоях образца, через которые он проходит, а интенсивность флуоресценции будет возрастать по мере приближения к точке фокусировки. Флуоресцентное излучение собирается объективом и возвращается на светоделитель, проходит сквозь него, попадая на эмиссионные фильтры. Отраженное излучение лазера через светоделитель не проходит. При необходимости многоканальной регистрации (например, при использовании нескольких флуорохромов) возможно дополнительное деление флуоресцентного сигнала на составляющие с помощью дополнительных светоделителей и фильтров эмиссии. Собранный из определенной точки образца свет фокусируется в плоскости конфокальной диафрагмы (pinhole), попадает на детектор (ФЭУ) и оцифровывается. При этом свет, исходящий из областей, находящихся выше или ниже плоскости фокуса, отсекается диафрагмой и на детектор не попадает. После регистрации флуоресцентного сигнала от первой точки фокусировки при помощи системы зеркал луч возбуждающего света перемещается на следующую точку в образце. Весь процесс повторяется. Так, точка за точкой, формируется изображение в горизонтальной (или вертикальной) плоскости.
Рис. 2. Принципиальная схема простейшего конфокального микроскопа
Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым изменяя толщину оптического слоя, от которого регистрируется сигнал. Однако следует понимать, что уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы (а, следовательно, и уменьшение толщины оптического слоя) приводит к снижению интенсивности света, который диафрагма пропускает к детектору и, соответственно ухудшению детекции объектов с неяркой флуоресценцией. В связи с этим приходится искать компромисс между разрешением по оси z , зависящим от размера конфокальной диафрагмы, и возможностью регистрации четких флуоресцирующих объектов, что зависит как от размера диафрагмы, так и от степени усиления регистрируемого сигнала.
Помимо диаметра конфокальной диафрагмы толщина оптического слоя зависит от длины волны возбуждающего света, числовой апертуры объектива, показателя преломления иммерсионной среды. В частности, чем больше числовая апертура объектива, тем меньше толщина оптического слоя.
Не менее важным параметром является разрешающая способность микроскопа. Вследствие дифракции света увеличенное изображение объекта может оказаться размытым (две или более точек объекта воспринимаются глазом как одна). Еще в XIX в. Джон Рэлей сформулировал принцип, в соответствии с которым предельное разрешение микроскопа не может быть больше половины длины волны освещающего объект света. Предел разрешения объектива микроскопа (l min) был уточнен немецким физиком Г. Гельмгольцем:
l min = 0,61λ/ n sin α,
где λ -длина волны света; n – показатель преломления иммерсионной среды; α -апертурный угол (максимальный угол, который образуют лучи, попадающие в объектив, с оптической осью системы).
Выражение NА = n sin α называют числовой апертурой.
Согласно формуле Гельмгольца, разрешение объектива микроскопа зависит от длины волны облучающего света и пропорционально числовой апертуре. Повысить разрешение также можно с помощью увеличения коэффициента преломления иммерсионной среды. Поскольку невозможно неограниченно уменьшать длину волны облучающего света и увеличивать числовую апертуру объектива, существует разрешающий предел – около 200 нм. Однако есть возможность улучшить качество изображения за счет увеличения контраста. Если установить диаметр конфокальной диафрагмы равным диаметру центрального пятна дифракционной картины точечного объекта (диску Эйри), то можно избежать попадания в объектив света от дифракционных колец. Применяя такую технологию, можно повысить контрастность примерно в 1,4 раза по сравнению с обычными микроскопами, а это приведет к заметному улучшению качества изображения. Аксиальное разрешение конфокального микроскопа также зависит от диаметра диафрагмы. Чем меньше диаметр диафрагмы, тем меньше толщина слоя, с которого снимается сигнал, следовательно, лучше аксиальное разрешение (свет из соседних точек, находящихся вне фокальной плоскости, задерживается диафрагмой). Величина конфокальной диафрагмы, равная размеру диска Эйри, рассчитывается программой, управляющей конфокальным микроскопом, для каждого сочетания объектива и используемых фильтров (1 Airyunit). Она легко может быть задана без дополнительных вычислений.
С более подробным описанием принципиальной схемы конфокального микроскопа и порядком работы его модулей можно ознакомиться в работах Э. И. Лежнева [и др.] (2001), Г. И. Штейна (2007); R. Y. Tsien (2006); B. J. Nair (2012).
Как указывалось выше, в конфокальной лазерной микроскопии изображение всего образца получают путем сканирования. Скорость поточечного сканирования ограничивает скорость работы микроскопа в целом и делает невозможным наблюдение за быстротекущими процессами. Чтобы избежать этого ограничения, на практике используют не одиночную диафрагму, а массив диафрагм и детекторов. Такие массивы размещают на диске Нипкова. Это устройство, изобретенное Паулем Нипковым в 1884 г., представляет собой вращающийся диск из непрозрачного материала с нанесенными на нем отверстиями одинакового диаметра, расположенными по спирали в один оборот, начиная от наружного края диска. Наблюдая объект через сектор быстро вращающегося диска Нипкова, можно заметить, что происходит его построчное сканирование. При более высокой скорости вращения объект можно увидеть целиком (Феофанов А. В., 2007).
Современный аналог диска Нипкова содержит 20 тыс. отверстий, на которых лазерный луч фокусируется при помощи дополнительного диска с микролинзами. При вращении такого двойного диска достигается считывание до 360 кадров в секунду. Однако стоит отметить, что диаметры отверстий и расстояния между ними на диске фиксированы и подбираются для конкретного объектива, следовательно, смена последнего требует замены диска.
Сегодня на смену вращающимся дискам Нипкова приходят их твердотельные неподвижные аналоги – цифровые микрозеркальные устройства (digital micromirror device, DMD). Эти устройства представляют собой массивы микрозеркал, которые соответствуют пикселям в проецируемом изображении и, отклоняясь в ту или другую сторону, управляют прохождением света. В конфокальной микроскопии они играют роль массива отверстий, фильтрующих возвращаемый образцом сигнал, с изменяемым диаметром и схемой расстановки.
Однако конфокальные микроскопы имеют и существенные недостатки. Так, возбуждение значительной части существующих флуорохромов осуществляется лазерным излучением ультрафиолетового или коротковолнового видимого диапазона, что разрушительно для живых клеток. Эта проблема была преодолена с введением в практику мультифотонных микроскопов, в которых в качестве подсветки используется излучение инфракрасного диапазона.
1.4. Мультифотонная микроскопия
Мультифотонная микроскопия – вариант лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, основанный на принципе Гёпперт-Майер, согласно которому с увеличением плотности мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, после чего атом излучает фотон большей энергии, чем при однофотонном поглощении. Несмотря на то что это явление было описано еще в 1931 г., первый мультифотонный микроскоп был применен для исследования биологических объектов Winfried Denk лишь в 1990 г. Это было связано с невозможностью до появления лазерной техники достичь на практике излучения большой плотности. В современных мультифотонных микроскопах высокая плотность мощности светового пучка обеспечивается за счет фокусировки лазерного излучения, а также благодаря уменьшению длительности лазерного импульса. Для этой цели применяются фемтосекундные лазеры с длительностью импульса около 10 - 13 с (100 фемтосекунд) и частотой порядка 100 МГц. Использование такой системы (при невысокой ее мощности) позволяет получить сигнал с малым уровнем фоновых шумов, достичь большей глубины проникновения в ткани при малой степени повреждения клеток. Кроме этого за счет отсутствия возбуждения и выцветания флуорохромов вне фокального объема отсутствует необходимость установки конфокальной диафрагмы, поэтому лазерный сканирующий микроскоп с мультифотонным возбуждением не является типичным конфокальным микроскопом. В качестве примера мультифотонного микроскопа можно привести комплекс лазерного сканирующего конфокального микроскопа Carl Zeiss LSM-710 с фемтосекундным инфракрасным лазером с перестраиваемым диапазоном (800 – 1500 нм). Использование этой системы позволяет получить глубину проникновения в ткани порядка 500 мкм и осуществлять непрерывный мониторинг живых объектов в течение нескольких часов.
Одним из вариантов мультифотонной микроскопии является микроскопия с использованием регистрации второй гармоники (Second-harmonic imaging microscopy – SHIM). Метод генерации второй гармоники основан на нелинейном оптическом явлении, суть которого заключается в преобразовании средой двух фотонов с частотой w в один фотон с частотой 2w. Это означает, что помимо света на частоте лазера из среды выходит свет на удвоенной частоте – вторая гармоника. Генерация второй гармоники обусловлена рассеянием света в среде и возможна при действии поляризованного лазерного излучения ближнего инфракрасного диапазона. Подробное изложение физико-химических основ этого процесса приведено в учебнике под редакцией Б. И. Манцызова (2009). Отметим, что не все биологические образцы могут генерировать вторую гармонику. Классическим объектом для этого вида микроскопии является роговица глаза, которая преимущественно состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон – источника генерации второй гармоники.
1.5. Конфокальная микроскопия в применении к исследованию динамических процессов и межмолекулярных взаимодействий
1.5.1. Восстановление флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Recovery After Photobleachin – FRAP)
Данная техника применяется для исследования подвижности биоорганических молекул, например для измерения коэффициента латеральной диффузии некоторого белка или для изучения полимеризации белков. Основной принцип метода заключается в том, что белок интереса метят флуоресцентной меткой, с помощью ослабленного аттенюаторами возбуждающего излучения регистрируют фоновую флуоресценцию; после этого на короткий промежуток времени (несколько миллисекунд) увеличивают интенсивность облучения, что приводит к выжиганию флуорохрома; затем снижают интенсивность до исходной и регистрируют флуоресценцию с отбеленного участка (Соболев А. С., 2000). Если молекулы с флуорохромом из соседней необлученной зоны (например, посредством диффузии) перемещаются в облученную область, то по времени нарастания флуоресценции можно судить об их подвижности. Несколько лет назад была разработана модификация этого метода – обратный FRAP или iFRAP, который с успехом применяется для изучения подвижности молекул в малом объеме или кинетики диссоциации молекул. В этой модификации фотоотбеливанию подвергаются флуоресцентно меченые молекулы во всей клетке за исключением малого объема, затем регистрируется изменение уровня флуоресценции в этом объеме (Dailey M. E. [еt al.], 2006).
1.5.2. Потеря флуоресценции во время фотоотбеливания (Fluorescence Lossin Photobleaching – FLIP)
Техника FLIP используется для выявления взаимодействий между молекулами из разных компартментов клетки или для изучения подвижности молекулы внутри компартмента. Например, для наблюдения передвижения определенного белка из цитоплазмы в ядро. Эксперименты в технике FLIP отличаются от FRAP и iFRAP тем, что выжигание флуоресценции в одной и той же области образца производится несколько раз с целью предотвращения восстановления флуоресценции в ней. При повторном отбеливании определенной области возникает потеря флуоресценции в пограничной области. По потере флуоресценции в области пограничной с облучаемой можно судить о передвижении фракции меченных флуоресцентным красителем белков и, наоборот, по остаточной флуоресценции можно определить долю неподвижных молекул. FLIP часто используется в комбинации с FRAP, чтобы получить обобщенную информацию об активном и пассивном перемещении меченых белков.
1.5.3. Локализация флуоресценции после фотоотбеливания (Fluorescence Localization After Photobleaching – FLAP)
С помощью метода FLAP можно в реальном времени следить за перемещением флуоресцентно меченой молекулы в пространстве. Техника FLAP была разработана Graham Dunn в 2002 г. и состояла в том, что к молекулам интереса пришивали две различные флуоресцентные метки, одну из которых отбеливали, а с помощью второй следили за перемещением молекулы. Для реализации этого метода оба красителя должны визуализироваться одновременно и независимо, тогда FLAP сигнал получают путем вычитания отбеленного сигнала из неотбеленного для каждого пикселя.
1.5.4. Фёрстеровская (флуоресцентная) резонансная передача энергии (Fӧrster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer – FRET)
Фёрстеровская резонансная передача энергии, или иначе диполь-дипольный перенос энергии, – это механизм переноса энергии между двумя молекулами (от донора к акцептору), который происходит без промежуточного испускания фотонов и является результатом диполь-дипольного взаимодействия между донором, находящимся в возбужденном состоянии, и акцептором. Характерная черта данного процесса – тушение флуоресценции донора и возникновение более длинноволновой флуоресценции у акцептора, которая детектируется конфокальным микроскопом. При этом перенос возбуждения сопровождается уменьшением времени жизни и квантового выхода флуоресценции донора, для которого акцептор выступает в роли тушителя. Скорость переноса убывает как r –6 , где r – расстояние между донором и акцептором, что используется для измерения расстояния между двумя молекулами или между двумя метками в одной молекуле. Для характеристики этого явления вводится понятие фестеровского радиуса (R F ) – это эффективное расстояние, на котором скорость перехода составляет 50 % от максимума (для большинства систем его величина составляет 20 – 50 Å). Если расстояние между донором и акцептором превышает 10 нм, то диполь-дипольный перенос энергии не возможен. Помимо расстояния скорость переноса зависит от степени перекрывания спектров испускания донора и поглощения акцептора, от взаимной ориентации диполей донора и акцептора и от времени жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора. Константа скорости переноса энергии k et определяется выражением:
где τ d – время жизни возбужденного состояния донора в отсутствие акцептора.
Для реализации технологии FRET необходимо, чтобы:
1) донорный зонд обладал достаточным временем жизни для осуществления переноса энергии;
2) молекулы донора и акцептора располагались на расстоянии 1 – 10 нм друг от друга;
3) спектр поглощения флуорохрома акцептора накладывался на спектр испускания флуоресценции флуорохрома донора (примерно на 30 %);
4) для переноса энергии ориентации диполя донора и акцептора были примерно параллельны друг другу;
5) пары флуорохромов соответствовали имеющимся в конструкции микроскопа лазерам.
Наиболее часто используемые пары донор – акцептор приведены в обзоре, расположенном на сайте http://www.mdpi.com/ 1420-3049/17/4/4047р. 4088.
Существуют несколько методов исследований FRET: фотоотбеливание акцептора/донора; метод спектральной конфокальной микроскопии в применении к FRET; микроскопия для исследования времени жизни флуоресценции (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) и метод поляризации флуоресценции (Ishikawa-Ankerhold Н. С. , 2012). В зависимости от задачи данные модификации метода FRET позволяют следить за конформационными изменениями в белках, изучать кинетику ферментативных реакций, исследовать белок-белковые и другие взаимодействия. Например, по изменению FRET-сигнала между Gá иGâã субъединицами G-белка, слитыми с флуоресцирующими белками CFP и YFP, можно охарактеризовать динамические характеристики диссоциации G-белка в живых клетках; две субъединицы никотиновых ацетилхолиновых рецепторов á4 и â2, слитые с YFP и CFP, послужили основой для разработки клеточных систем, на основе которых с применением спектральной конфокальной микроскопии показана возможность измерять уровень á4â2-рецепторов и изучать процессы их сборки-диссоциации под воздействием различных стимулов. С помощью методики FLIM смогли в системе реального времени отслеживать уровень фосфорилированной формы эпидермального фактора роста (ЭФР), для чего к ЭФР пришили GFP, а к антителам, реагирующим с фосфоЭФР, – Cy3 (Grigsby C. L. , 2012; Zeug A. , 2012).
Литература
Голышевская В. И., Егорова О. В., Севастьянова Э. В., Шульгина М. В. Люминесцентная микроскопия: учебное пособие для проведения курсов обучения: «Культуральные методы диагностики туберкулеза», «Выявление туберкулеза методом микроскопии». – М.; Тверь: Триада, 2008. – 36 с.
Лукашева Н. Н., Ткаченко С. Б., Потекаев Н. Н., Кузьмина Т. С., Василевская Е. А. Прижизненная отражательная конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: история создания, принцип работы, возможности применения в дерматологии // Клиническая дерматология и венерология. – 2008. – № 5. – С. 10 – 15.
Манцызов Б. И. Когерентная и нелинейная оптика. – М.: ФИЗМАТЛИТ, 2009. – 208 с.
Олейников В. А . Полупроводниковые флуоресцентные нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорг. химия. – 2011. – 37 (2). – С. 171 – 189.
Сайфитдинова А. Ф. Двумерная флуоресцентная микроскопия для анализа биологических образцов: учебно-методическое пособие. – СПб.: СОЛО, 2008. – 72 с.
Соболев А. С. Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – Т. 6. – № 4. – С. 2 – 6.
Феофанов А. В. Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях // Успехи биологической химии. – 2007. – Т. 47. – С. 371 – 410.
Фейнман Р. Фейнмановские лекции по физике:в9 т. – 6-еизд. сущ. испр. – М.: УРСС: Издательский дом «ЛИБРОКОМ», 2011. – Т. 3: Излучение. Волны. Кванты. – 264 с.
Штейн Г. И. Руководство по конфокальной микроскопии. – СПб.: ИНЦ РАН, 2007. – 77 с.
Dailey M. E., Manders E., Soll D., Terasaki M. Chapter 19 Confocal Microscopy of Live Cells In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 381 – 404.
Grigsby C. L., Ho Y. P., LeongK. W. Understanding nonviral nucleic acid delivery with quantum dot-FRET nanosensors // Nanomedicine (Lond). – 2012. – Vol. 7 (4). – P. 565 – 577.
Ishikawa-Ankerhold H. C., Ankerhold R., Drummen G. P. C. Advanced Fluorescence Microscopy Techniques – FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM // Molecules. – 2012. – Vol. 17. – Р. 4047 – 4132.
Nair B. J., Sivakumar T. T., Joseph A. P., Varun B. R., Mony V. Confocal microscopy // Health Sciences. – 2012. – 1(3): JS004A. – Р. 1 – 6.
Tsien R. Y., Ernst L., Waggoner A. Fluorophores for Confocal Microscopy: Photophysics and Photochemistry In «Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd Ed.». – New York: Springer, 2006. – Р. 338 – 352.
Zeug A., Woehler A., Neher E., Ponimaskin E. G . Quantitative intensity-based FRET approaches – a comparative snapshot // Biophys. J. – 2012. – Vol. 103 (9). – Р. 1821 – 1827.
Приведённый ознакомительный фрагмент книги Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии (Коллектив авторов, 2014) предоставлен нашим книжным партнёром -
Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.
Конфокальную флуоресцентную микроскопию можно рассматривать как разновидность традиционной флуоресцентной микроскопии, которая позволяет исследовать внутреннюю микроструктуру клеток, причем не только фиксированных, но и живых, идентифицировать микроорганизмы, структуры клетки и отдельные молекулы, наблюдать динамические процессы в клетках. Конфокальная флуоресцентная микроскопия в дополнение к этому обеспечила возможность трехмерного субмикронного разрешения объекта и существенно расширила возможность неразрушающего анализа прозрачных образцов. Повышение разрешающей способности достигается благодаря использованию в конфокальных микроскопах лазеров в качестве источников света и конфокальной диафрагмы для фильтрации внефокусной флуоресценции. Преимущество лазеров по сравнению с ртутными или ксеноновыми лампами заключается в монохроматичности и высокой параллельности испускаемого пучка света. Эти свойства лазерного излучения обеспечивают более эффективную работу оптической системы микроскопа, уменьшают число бликов, улучшают точность фокусировки пучка света. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Конечно, при этом лазерный луч возбуждает флуоресценцию как в точке фокуса, так и во всех слоях образца, через которые проходит. И если эта внефокусная флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива, это ухудшает разрешение оптической системы. Избавиться от внефокусной флуоресценции позволяет конфокальная диафрагма. Изменяя диаметр конфокальной диафрагмы, можно определять толщину оптического слоя вблизи фокуса лазерного луча, поэтому флуоресценция, испускаемая выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и не регистрируется. Благодаря этому конфокальная микроскопия обеспечивает улучшенное разрешение, в первую очередь вдоль оси Z.
Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.
Благодаря улучшенному разрешению, особенно повышенному разрешению по оси Z, и возможности создавать серии «оптических» срезов, конфокальный микроскоп позволяет исследовать тонкую структуру объекта в трехмерном пространстве. Специальные программы позволяют создать из серии оптических срезов объемное изображение объекта (3D) и как бы рассматривать его под разными углами зрения, что может дать ценную информацию о форме клеток, цитоскелете, структуре ядра, хромосомах и даже локализации в них отдельных генов, а так же о взаиморасположении этих элементов.
Использование мультиспектрального (с несколькими флуорохромами) режима работы лазерного сканирующего конфокального микроскопа позволяет исследовать колоколизацию (пространственное взаиморасположение) в клетке двух или более разных веществ, например, белков, помеченных разными флуоресцентными красителями. Исследуя такие препараты в обычном флуоресцентном микроскопе, нельзя с уверенностью утверждать, находятся эти вещества рядом или одно под другим. С помощью метода оптических срезов и дальнейшей 3D-реконструкции объекта можно воссоздать объемное распределение веществ. Мультиспектральный режим так же позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования методом FISH.
Методы конфокальной микроскопии позволяют выявить способность веществ накапливаться в цитоплазме, ядре или других структурах клетки, зарегистрировать образование метаболитов, измерить кинетику накопления и метаболизма веществ в клетке, скорость выведения веществ из клетки, сравнить интенсивность метаболизма в различных клеточных линиях и в различных условиях. Эти методы все шире применяются в исследованиях механизмов действия как канцерогенов, так и лекарственных препаратов и противоопухолевых соединений, позволяют рассчитывать их эффективные концентрации.Анализ интенсивности и формы спектров собственной флуоресценции позволяет распознавать нормальные и воспаленные клетки, и такой метод, в частности, предложен в качестве нового способа ранней диагностики шейки матки.
Подобрав комбинацию фильтров для нескольких типов собственной флуоресценции, возможно без проведения гистохимического окрашивания и трудоемкого получения и исследования множества срезов различать злокачественные и нормальные тканевые структуры в биопсийных пробах лимфоузлов пациентов с лимфоаденопатией различного происхождения.
Методы конфокальной микроскопии широко применяются в эмбриологии и гидробиологии, ботанике, зоологии при изучении структуры гамет, развития и формирования организмов.
